循環腫瘤細胞（CTC）

一、什么是循環腫瘤細胞 (CTC)

循環腫瘤細胞 (CTC) 是從原發性腫瘤脫落到血液系統或淋巴系統并在血液循環中攜帶到全身的細胞。CTC可以滲出并成為遠處器官中額外腫瘤（轉移瘤）隨后生長的種子，這種機制是造成絕大多數癌癥相關死亡的原因。CTC 的檢測和分析可以幫助早期患者預后并確定適當的定制治療。

二、循環腫瘤細胞 (CTC)的發展歷史

1869年，Thomas Ashworth首次在一名患有轉移性癌癥的男性血液中觀察到了CTC，將循環細胞的形態與來自不同病變的腫瘤細胞進行徹底比較后，Ashworth 得出結論：“有一件事是肯定的，如果它們 （指CTC）來自現有的癌癥結構，它們一定已經通過了大部分的腫瘤細胞。循環系統到達健全腿的內隱靜脈”。

CTC在現代癌癥研究中的重要性始于 1990 年代中期，當時證明 CTC 存在于疾病的早期階段。Paul Liberti 發明的采用鐵磁流體（膠體磁性納米粒子）和高梯度磁選機的精密靈敏磁分離技術使這些結果成為可能。從那時起，各種其他技術已應用于 CTC 計數和鑒定。

現代癌癥研究表明，CTC 來源于原發腫瘤的克隆，證實了 Ashworth 的說法。為理解CTC 的生物學特性所做的重大努力已經證明循環腫瘤細胞在癌的轉移擴散中起著關鍵作用。此外，高度敏感的單細胞分析表明，在單細胞水平上，蛋白質表達和蛋白質定位存在高度異質性，CTC 反映了原發性活檢和轉移部位的變化。

三、循環腫瘤細胞 (CTC)的優勢

CTC或液態活檢的檢測與傳統組織活檢相比具有幾個優勢。
1. 它們是非侵入性的，可以重復使用，并提供有關轉移風險、疾病進展和治療效果的更多有用信息。例如，對癌癥患者血液樣本的分析發現，隨著疾病的進展，CTC 檢測有增加的傾向。
2. 進行血液檢測既簡單又安全，并且隨著時間的推移可以采集多個樣本。相比之下，實體瘤的分析需要侵入性程序，這可能會限制患者的依從性。
3. 隨著時間的推移監測疾病進展的能力可以促進對患者治療的適當修改，從而可能改善他們的預后和生活質量。預測疾病未來進展能力的重要方面是消除在重復 CTC 計數低且不增加時進行手術的需要；避免手術的明顯好處包括避免與癌癥手術的先天致瘤性相關的風險。

四、循環腫瘤細胞 (CTC)的特征

CTC分為不同的類型：上皮型、間質型和混合型。他們的惡性程度差別很大，手術治療可將原發腫瘤病灶鏟除，但之前釋放的CTC仍殘留在血管中，手術治療后通常會配合藥物治療，大部分殘留的CTC會受到藥物和免疫系統的攻擊而被殺死，但是有一部分CTC特別是間質型CTC有很強的耐藥性，他們能躲避藥物和免疫系統攻擊存活下來。存活下來的CTC會隨著血液循環另尋新的轉移陣地，這也是腫瘤復發轉移的原因。

循環腫瘤細胞（CTC）通常具有非典型性的細胞形態，一般比血液細胞，正常組織細胞體積大；細胞核大，不規則，細胞核質比高；不易發生變形。

在轉移性疾病患者中，循環腫瘤細胞的頻率約為每毫升全血 1-10 個CTC。相比之下，一毫升血液含有幾百萬個白細胞和十億個紅細胞。這種低頻率與識別癌細胞的困難相關，意味著理解 CTC 生物學特性的一個關鍵組成部分需要能夠從每毫升血液中分離出 1 個 CTC 的技術和方法，或者通過富集，或者更好的是通過無富集分析來識別所有 CTC 亞型都具有足夠高的清晰度，以滿足各種癌癥類型患者的診斷病理圖像數量要求。迄今為止，已在多種上皮癌（乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結腸癌）中檢測到 CTC，臨床證據表明，具有轉移性病灶的患者更有可能分離出 CTC。

五、循環腫瘤細胞 (CTC)的富集

一般來說，外周血中CTC的數量極少，1ml血液中約有4×109紅細胞、2×108血小板、6×106白細胞，而CTC只有1-10個，因此CTC的檢測面臨巨大的技術挑戰。

常用的CTC富集方法包括非特異性富集法和特異性富集法。非特異性富集法主要是依據形態學原理，包括：密度梯度離心法、過濾法、細胞電學特征法等，這種非特異性的方法往往具有一定的局限性，如：富集效率低、靈敏度和特異性較低、易受細胞形態影響等。特異性富集法多數是依據抗原抗體原理，包括：免疫磁珠富集法、芯片法、納米粒富集法等，其中免疫磁珠法又分為陰性富集（負選）和陽性富集（正選），常見的陰性富集法是利用耦連CD45抗體的磁珠吸附白細胞，在磁場作用下去除白細胞，富集CTC；陽性富集是通過偶聯EpCAM抗體的免疫磁珠捕獲EpCAM陽性的CTC，適用于EpCAM或CK陽性的CTC。

六、循環腫瘤細胞 (CTC)的分析與鑒定

利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，接下來還需要結合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術不能保證百分之百的純度，需要對所得到的細胞進行鑒定，以進一步確定CTC細胞的數目，以減少CTC數目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發生發展過程中，不僅CTC的數目在動態的變化，CTC所攜帶的分子標志物也在變化，通過對CTC表面標志物檢測，能夠反應腫瘤發生發展的動態變化，是研究腫瘤發生發展機制的有效策略，并能很好地指導臨床治療。常用的CTC檢測技術如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測序等。

1. 免疫熒光法（IF）: 實體腫瘤細胞一般均為上皮來源，細胞內會表達角蛋(cytokeratin, CK)或其他腫瘤標示物(如HER2)。借助免疫熒光染色，可對來自實體瘤CTC中的瘤標進行識別，從而達到檢測CTC的目的。這也是目前檢測CTC的最常見方法。缺點是在CTC形成過程的間質化(EMT)階段，大量的CK會降解，從而在CTC檢測過程中出現假陰性，為此需要其他腫瘤細胞表面標示物 (如 EpCAM、HER2、CA19-9 等) 染色作為補充，以提高 CTC 檢出的陽性率。免疫熒光法是目前最常用的方法。

2. 熒光原位雜交（FISH）: 熒光原位雜交，是根據已知細胞內特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與細胞內的基因組中DNA分子雜交，檢測該特異基因序列的存在與豐度。FISH技術與CTC結合，不僅可以檢測CTC表面標志物，也可以檢測CTC細胞內部的標志物及核型等

3. 反轉錄PCR: 提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用引物和逆轉錄酶將mRNA反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。結合RT-PCR可同時對若干個基因的表達進行檢測。位點特異性PCR技術可用于檢測CTC攜帶的驅動基因的突變情況。

4. 二代測序 : CTC數量少，直接進行二代測序難度大。需要將單細胞的DNA擴增后，再利用二代測序檢查基因序列。但是，目前單細胞測序的技術僅僅停留在實驗室階段，未來向市場推廣還有很長的路要走。而且由于腫瘤細胞的異質性，單細胞測序是否有代表性還需要更多的科學研究來證明。

七、循環腫瘤細胞 (CTC)的未來發展方向

CTC檢測是對抗癌癥的關鍵工具，在癌癥早期診斷、治療監測、復發監測和用藥指導中起著關鍵性作用。“稀有性”是CTC檢測最大的難點，如何從幾億個血細胞中精準捕獲幾個CTC細胞？富集效率極為重要。因此迫切需要開發一種更靈敏、更具特色、更簡便高效的檢測系統。CTCs 檢測的臨床實用性需要進行進一步的大規模的研究進行驗證，但其多功能性和優勢為癌癥的診斷和預后提供了新的工具，相信在未來幾年循環腫瘤細胞將大大促進精準腫瘤學領域的發展。

廣州浩康生物科技有限公司