如何高效進行線蟲觀察

40多年來，秀麗隱桿線蟲一直被用作神經科學、發育和分子生物學以及遺傳學的模式生物。它是第一個對其整個基因組進行測序的多細胞生物，并且直到現在，它也是世界上唯一被完整繪制出神經網絡的生物。秀麗隱桿線蟲中的大量基因可以以與哺乳動物相似的方式發揮作用。秀麗隱桿線蟲基因組中大約 1/3 的基因與某些人類基因同源，因此，該線蟲可用作研究人類相關疾病的模式生物。線蟲在實驗室中培養非常容易和快速，通常保持在略低于室溫 (15–20 °C) 的溫度。成蟲長約 1 毫米，直徑小于 75 微米。它們保存在瓊脂平板上，即培養皿內的瓊脂凝膠，以細菌（大腸桿菌）為食物。

線蟲的常規實驗室工作有幾個常見步驟：
1. 挑選線蟲；
2. a） 轉基因：將轉基因顯微注射到線蟲中以修改其基因組；b） RNA干擾（RNAi）：將雙鏈（ds）RNA引入線蟲以抑制基因表達；
3. 篩選：評估線蟲以檢測成功的 RNAi 或轉基因；
4. 用各種方法研究線蟲的分子生物學、生物化學、遺傳學；
5. 線蟲的記錄或功能成像，通常使用共聚焦或復合顯微鏡完成。

首先，必須選擇和挑選線蟲，然后是基因或蛋白質表達的操作，然后是一段時間的線蟲繁殖。然后根據表型區分線蟲，以找到對應特征的線蟲。如果這些線蟲太少，可能會重復前面的步驟。當有足夠數量的具有感興趣特征的線蟲時，它們將被再次挑選、固定，最后進行功能成像。上面顯示的工作步驟不一定按序號順序完成。

一般線蟲培養、挑選、篩選蟲等時需要考慮的幾點：
a. 每個平板中的瓊脂量相同（高度相同）保證更換瓊脂平板時避免重新聚焦；
b. 瓊脂上的細菌（食物）濃度更低保證獲得更清晰的線蟲顯微鏡圖像
c. 具有薄瓊脂層且無蛋白胨可減少線蟲成像板的熒光背景（自發熒光）
d. 良好的對比度對透射光可將線蟲與瓊脂區分開來
e. 良好的熒光信噪比 (S/N) 和暗背景可檢測更微弱的熒光信號以獲得更好的圖像結果
f. 當以更高的總放大倍數（60 倍以上）對線蟲成像時，確保良好的對比度和高分辨率。

在挑選合適的線蟲并準備它們進行遺傳或生化分析時，通常使用體視顯微鏡選擇線蟲并用小鉑絲或睫毛挑選。然后，為了通過顯微注射在線蟲的性腺中進行基因改造，將它們放置在載玻片上的一個小的干燥瓊脂墊上。

明場中的線蟲篩查

使用多個體視顯微鏡可以實現對線蟲的有效篩選以提高數量。 配備燈架或小型照明底座的浩康生物HZ6100常規體視顯微鏡非常適用于線蟲篩查。當與輔助物鏡一起使用時，它可以實現更高的放大倍率和分辨率。由于其緊湊的設計，HZ6100在實驗室中占用的空間也更少。 使用這些顯微鏡可以輕松制作具有高對比度的線蟲圖像，即使在低放大倍率下也是如此。對于教學人員來說，它們也是特別好的解決方案。

下面列出了在使用HZ6100在明場中進行線蟲篩查的不同優勢。
★由于有足夠的空間同時容納多個瓊脂平板，因此簡化了標本處理，最大限度地減少了平板意外掉落的可能性；
★用于取蟲、顯微注射等操作，有足夠的空間讓用戶的手在物鏡周圍和下方工作；
★學生課程的干凈設置，因為沒有外部燈、電纜，也沒有可能從底座上掉下來的設備；
★由于居中 LED，標本成像具有良好的對比度和均勻的照明；
★不使用時易于存放，因為整個顯微鏡裝置很容易放在壁櫥架子上。

浩康生物 HZ7100體視顯微鏡也可以實現高效的線蟲篩查。 HZ7100有一個共同的主物鏡 (CMO)，因此沒有傾斜的焦平面，雙眼的整個視野都清晰對焦。 此外，該系統是模塊化的，允許您非?？焖俚仂`活添加、交換或更換組件。如果需要多個用戶同時觀察標本圖像，并記錄高分辨率圖像以供報告，則可以安裝數碼相機。例如，具有630萬或更多像素的相機HS600E/HS2000E可以生成高清 (HD) 實時圖像和錄制圖像。

轉基因、顯微注射和 RNAi

有一些方法可以改變線蟲的基因/蛋白質表達。通過對線蟲進行顯微注射來進行穩定和瞬時的基因修飾。 兩種主要方法是：轉座子，也稱為跳躍基因，或CRISPR/Cas9系統。CRISPR 的轉基因產量較低，需要一個世代周期進行選擇，但轉基因插入更穩定。轉座子方法效率更高，產量更高，需要注射的線蟲更少，但轉基因整合到基因組中的位置并不總是很清楚。

一旦將線蟲放在載玻片上的干瓊脂墊上，重要的是要快速工作，否則線蟲可能會在操作過程中干燥并死亡。為了減緩線蟲的干燥，通常它會被油覆蓋，例如鹵化碳或石蠟。通常，顯微注射應在 5 分鐘內完成。將帶有瓊脂墊的載玻片放在倒置顯微鏡的載物臺上，找到一條線蟲，并將轉基因 (DNA) 注入遠端性腺。

然后用恢復緩沖液覆蓋線蟲，用鉑絲或睫毛挑起并放置在單獨的瓊脂板上進行進一步培養和繁殖。此工作步驟通常在配備微分干涉對比 (DIC) 或集成調制對比 (IMC) 照明的手動倒置熒光顯微鏡上執行，例如 Leica DMi8或浩康生物HIF2000。強烈建議在顯微鏡下設置抗震裝置以獲得更高的產量。

對于顯微注射針的精確定位，使用高精度3軸油機械手是實用的，例如來自 Narishige Instruments 的機械手

RNA 干擾 (RNAi) 用于在翻譯水平上改變蛋白質表達。它是通過用表達雙鏈 (ds) RNA 的轉基因細菌喂養線蟲來實現的。線蟲攝取 dsRNA，它進入線蟲的所有細胞（神經元除外），經過細胞生化處理，然后產生短干擾 (si) RNA。一旦存在于細胞中，siRNA 就會改變蛋白質表達。

轉基因線蟲育種及熒光篩選

顯微注射后，線蟲進一步培養，下一代用于實驗。線蟲保持在 20°C 以進行繁殖。必須避免線蟲干燥，因此瓊脂平板通常存放在塑料盒中。要獲得大量的線蟲，第二種可能是在錐形瓶中進行液體培養。

大約5條線蟲足以進行蛋白質印跡分析（識別蛋白質）。然而，差分梯度離心需要 10萬條線蟲才能按密度分離細胞器和蛋白質。

由于轉基因通常與綠色熒光蛋白 (GFP)結合，因此可以使用熒光體視顯微鏡對其進行選擇。其他熒光標記如 DsRed在高表達水平下可能有毒，因此通常選擇 GFP 標記。

使用明場定位線蟲，檢查熒光信號，然后挑選進行其他實驗。對于成像，通常首選較年輕的線蟲，因為較老的線蟲通常表現出更高的自發熒光，尤其是在腸道中。將選定的線蟲放在特殊的小瓊脂板上，不含蛋白胨和細菌，以最大限度地減少自發熒光。瓊脂層通常非常薄以進一步減少自發熒光。使用浩康生物HZF7000/HZFX800體視熒光顯微鏡，可以對線蟲進行高效熒光篩查。

熒光篩查的重要考慮因素
★為了獲得最高的對比度和分辨率，選擇合適的底座；
★選擇很少產生或沒有熒光成像的背景光“噪音”的底座；
★使用帶有雙面鏡凹面的底座時，在高倍率下可獲得更好的對比度和更高分辨率的圖像。
★使用帶有外部光源的底座時，避免在不需要時加熱線蟲。
★對于高自發熒光的情況，降低熒光激發強度會增加信噪比。在許多情況下，來自線蟲的熒光信號是最大的，并且不能增加更多，但背景總是可以。

功能成像
正置共聚焦和熒光顯微鏡，例如HF3000正置熒光顯微鏡，通常用于線蟲的成像和記錄以獲得亞細胞的高分辨率圖像和大分子結構。

對于共聚焦成像，線蟲表達熒光蛋白，即 GFP、紅色熒光蛋白（RFP、mCherry 或 DsRed）、黃色熒光蛋白（YFP）或青色熒光蛋白（CFP）。

線蟲位于板中瓊脂層的頂部需要正置共聚焦和熒光顯微鏡。線蟲移動相對較快，所以它們通常被藥物Levamisol麻醉，然后將蓋玻片放在它們上面，以便通過液浸物鏡進行觀察。幼蟲階段的幼蟲對光非常敏感，因此使用共聚焦共振掃描儀，由于停留時間短，可以將光毒性問題降至最低。共振掃描儀允許對線蟲幼蟲進行長期觀察，而不會造成明顯的損壞

總結

線蟲的常用方法涉及使用體視顯微鏡和熒光顯微鏡等多個工作步驟。線蟲實驗室的需求可能會有所不同，可以使用多種儀器配置來解決工作步驟中的特定任務

以下是常用顯微鏡解決方案的列表:
一、線蟲挑選通常使用普通體視顯微鏡（如浩康生物HZ6100）進行，使用產生高對比度的透射光底座；
二、轉基因顯微注射是通過倒置熒光顯微鏡（如浩康生物HF3000）實現的，使用顯微操縱器定位針頭和 DNA 注射器；
三、熒光篩選可以使用體視熒光顯微鏡（如浩康生物HZF7100 或 HZFX800）；
四、使用透射光底座實現非常好的對比度；
五、明場篩選通常使用普通主物鏡 (CMO) 體視顯微鏡進行（如浩康生物 HZ7100）；
六、功能成像，即用于細胞分化、細胞凋亡、衰老、神經元活動等研究的轉基因線蟲的表征，是通過正置熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡完成的；
七、固定的線蟲也可以使用更高性能的熒光體視顯微鏡（如浩康生物 HZF7100）和透射光底座；為了對線蟲胚胎進行成像，建議使用共焦共振掃描儀以實現低光毒性；對于教室、教學實驗室和培訓，顯微鏡設置要求可能與研究實驗室不同。

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